實驗十 TLC與綠葉色素的分離

一、目的

學習液相萃取和薄層色層分析技術來分離綠葉中的色素。

二、原理

色層分析法（chromatography）簡稱層析法，是目前最為廣泛應用的混合物分離方法，雖然層析法的種類和應用非常多樣，但最基本的操作原理皆是將混合物溶於會流動的「動相」（或稱移動相，mobile phase，可為氣體或液體）中，流經被固定住的「靜相」（或稱固定相，stationary phase，可為液體或固體），混合物中不同成份會因為與動相、靜相間的交互作用差異而有不同的流動速度，藉此達到分離的目的。

混合物中成份A在動相與靜相間達成平衡：

式中 c_S、 c_M 分別為A在靜相與動相之中的濃度，K 被稱為分配係數（partition coefficient）。當動相以流速 u 開始流動時會帶動 A 一起前進，但 A 因為不斷在動相和靜相間移動分配，因此 A 的移動速度 v  必定小於 u，我們可簡單估計兩者間的關係：

V_S、V_M 分別為靜相和動相的體積。若混合物中另一成份 B 具有和 A 不同的分配係數，就會有不同於 A 的流動速度，而可和 A 分離。

層析法可依照使用的動相/靜相、型態或使用設備不同而有許多分類。最簡易的薄層色層分析（thin layer chromatography, TLC）的動相為液體，靜相為固體吸附劑，若由型態區分，則因靜相是均勻塗抹在一平板上，被稱為平板式（planar）。另一常見的型態是將靜相裝填於管柱中的管柱式（column）。

在本實驗中，我們先將欲分析的混合物溶液點在 TLC 片的矽膠（silica gel）吸附劑，也就是靜相上，使其被靜相吸附。當 TLC 片一端浸入作為動相的展開液時，展開液會因毛細作用而流過靜相，將分析物溶解並帶動。因矽膠表面有許多高極性的 -OH 基，而展開液的極性較低，所以可用於分離極性不同的分析物。在固定實驗條件下，一分析物在 TLC 片上的移動距離與展開液的移動距離之比值為一定值，不受其濃度和混合物中其他成份的影響。此比值稱為該成份之滯留因子 R_f（retention factor）：

三、器材及藥品

器材：

研缽及杵、100 mL 燒杯、量筒、錶玻璃、分液漏斗、TLC 片、玻璃毛細管、濾紙、鑷子

藥品：

乙酸乙酯（ethyl acetate, EA）、正己烷、飽和食鹽水、硫酸鎂、樹葉

實驗安全注意事項

• 實驗所用有機溶劑具揮發性且易燃，務必於抽風櫥內操作，並拉下抽風櫥玻璃門。
• 勿將有機溶劑倒入水槽。

四、實驗步驟

1. 將樹葉洗淨後撕成碎片，以研缽和杵磨碎，加入乙酸乙酯約 15 mL 萃取色素。

2. 將萃取液倒入分液漏斗中，再加入約 15 mL 飽和食鹽水，劇烈振盪後，靜置使水層（下層）與有機溶劑（上層）分開，收集上層有機溶劑萃取液於 100 mL 燒杯中。

3. 加入少量硫酸鎂乾燥劑除水（若萃取液揮發可酌量添加乙酸乙酯），再以傾析法或重力過濾法將萃取液倒入一乾燥的 100 mL 燒杯，置於加熱板上溫和蒸發溶劑以濃縮至少量液體，但注意勿完全蒸乾導致色素在高溫下變質。

4. 取 TLC 片，於一端的 1 cm 處，用鉛筆小心輕畫（避免將靜相刮傷）上起點線，並標示一起點記號，於另一端 0.5 cm 處畫上終點線。TLC 片勿沾到水以免損壞。

5. 取毛細管沾取濃縮液，迅速點在起點處，使少量試液，毛細管在 TLC 片上停留時間不可過久以免色點因擴散而太大（色點直徑小於 2 mm 為佳）靜置使其自然乾燥，若顏色過淡可重複操作至所需濃度。

6. 和其他組合作，分別配製不同比例混合的（乙酸乙酯/正己烷）展開液三至五種各 10 mL。混合比例建議在（乙酸乙酯/正己烷） =  1/9 至 8/2 間。

7. 和其他組合作，測試不同混合比例的（乙酸乙酯/正己烷）展開液對 TLC 實驗的影響。

   取 100 mL 燒杯，加入（乙酸乙酯/正己烷）展開液約 5 mL，並於器壁放置一濾紙，以錶玻璃覆蓋燒杯，藉以防止溶劑揮發並可使燒杯內之蒸氣壓迅速達到飽和。

8. 將 TLC 片直立置入燒杯內，起點端浸入展開液，但勿使其淹沒起點，蓋上錶玻璃。

9. 當展開液到達 TLC 片終點線時，取出 TLC 片，立即以鉛筆沿溶劑前端描線。待其自然乾燥，再以鉛筆將展開的色點標示出來。

10. 玻璃器材上殘留之植物色素若無法以水和清潔劑洗淨，可使用滴管取少量乙酸乙酯溶解洗去。

11. 廢棄物分類回收：

    • 硫酸鎂固體、TLC 片  →  一般固體廢棄物；

    • 乙酸乙酯、正己烷及混合液  →  有機溶劑（不含鹵素）；

    • 玻璃毛細管  →  指定收集桶

五、實驗結果

繪出 TLC 片結果並計算各色點的 R_f 值

六、問題與討論

1. 使用分液漏斗進行萃取時，為何需要適時放氣？

2. 萃取時使用飽和食鹽水的目的為何？為何不能使用自來水代替？

3. 明燒杯中放一張濾紙之作用為何？

4. 極性較大的色素分子，在實驗中會有較大還是較小的 R_f 值？

5. 請根據你的實驗結果，討論不同極性的展開液對實驗結果的影響與可能原因。