實驗二十一  酵素催化反應

一、目的

由酵素催化反應中產物濃度與時間的關係，進行簡單動力學分析，並認識酵素催化反應基本特性。

二、原理

催化劑能藉由改變反應途徑而改變化學反應的速率，但無法改變化學反應的熱力學特性與平衡。生物體內維持生命所需的物質與能量，絕大多數藉由催化劑來控制特定化學反應來產生，這些催化劑大多是蛋白質，被稱為酶或酵素（enzyme）。因為蛋白質分子的性質會受到環境，如酸鹼、溫度、溶液中其他分子影響，所以酵素必須在特定環境下才能表現活性（催化反應的能力）。

德國化學家 L. Michaelis 和 M. Menten 曾提出一簡單的酵素催化反應的化學動力學模型：

E：酵素  ；  S：反應物（substrate）

      E + S  →  ES              rate = k₁[E][S]

            酵素和反應物結合成為複合物（complex）

      ES  →  E + product           rate = k₂[ES]

            複合物發生反應

      ES  →  E+S                     rate = k₁^’[ES]

            複合物可能未發生反應就分解

產物生成速率 = k₂[E]₀[S]/(K_M+[S])

             [E]₀ 為酵素總濃度；K_M=( k₁^’ + k₂)/ k₁

本實驗使用的酵素是辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP，分子量約 34 kDa），能催化過氧化物對芳香環類化合物的氧化反應，我們可選擇具有特殊顏色的產物或反應物以便觀察。實驗所選用的催化反應：

無色的鄰苯二胺（o-phenylenediamine, OPD）與過氧化氫間的氧化反應速率極慢，若被辣根過氧化物酶催化，則可快速形成橘色的 2,3-二胺基吩嗪（2,3-diaminophenazine, DAP）產物。這是一個常被應用在生化檢測上的催化反應。

本實驗中我們將在不同反應時間，使用分光光度計觀察溶液中 DAP 對波長 470 nm 的光的吸收，利用比爾定律可簡單獲得反應期間各時間點溶液中 DAP 的濃度。

三、器材及藥品

器材：

滴管、試管、分光光度計（spectrophotometer）、塑膠製比色槽（cuvette）

藥品：

鹽酸鄰苯二胺（o-phenylenediamine (OPD) dihydrochloride）

、辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）

、2-(N-嗎啉)-乙基磺酸（2-(N-morpholino)ethane sulfonic acid, MES）/ 鈉鹽混合物（MES hemisodium salt）

、過氧化氫

四、實驗步驟

溶液配製（助教及指定同學統一配製）

1. 0.05 M 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸緩衝溶液（MES buffer），pH ≈ 6.1

2. 使用 MES buffer 配製 0.25 mM 鹽酸鄰苯二胺（OPD）溶液。

3. 使用 MES buffer 配製 5.5 nM 辣根過氧化物酶（HRP）溶液。

4. ~3% 過氧化氫水溶液。

分光光度計校正

5. 參考附錄（五）將分光光度計波長設定為 470 nm，使用 MES buffer 進行 100%T/0A（光百分之百穿透/無吸收）和 0%T（無光穿透）校正。將偵測模式設定為 A（吸收度）。

酵素催化反應偵測

Part I.

6. 乾淨試管中加入 OPD 溶液 6.0 mL，以滴管加入兩滴稀釋過氧化氫水溶液（勿多加）。

7. 加入 HRP 溶液 1.0 mL，搖搖晃試管使其混合均勻，開始計時。

8. 取反應溶液置入乾淨比色槽，裝至約八分滿，放入分光光度計開始量測。由反應開始 20 秒後，每隔 20 秒記錄吸收度值，紀錄 5 分鐘，之後改為每 60 秒記錄一次。偵測時間共計 10 分鐘。

9. 取出比色槽，勿倒掉裡面反應溶液，保留讓其繼續反應，待步驟 16. 使用。

Part II.

10. 乾淨試管中加入 OPD 溶液、MES buffer 各 3.0 mL，以滴管加入兩滴稀釋過氧化氫水溶液。

11. 重複步驟 7.-8.。

12. 取出比色槽，丟棄反應溶液，以滴管吸取蒸餾水約 2 mL 清洗三次。

Part III. 加熱對酵素催化反應的影響

13. HRP 溶液 1.0 mL 置於乾淨試管中，於 70-100°C 之熱水浴中加熱約 3 分鐘，取出冷卻。

14. 加入 OPD 溶液 6.0 mL、兩滴稀釋氧化氫水溶液，搖搖晃試管使其混合均勻，開始計時。

15. 重複步驟 8.。

Part IV. 產物最終吸收偵測

16. 將步驟 9. 中保留，裝有反應溶液的比色槽放入分光光度計中量測。

17. 假設此時 OPD 已完全被氧化為 DAP，由溶液中 OPD 濃度計算 DAP 濃度，並求出比爾定律公式  A = ε × l × c  中  ( ε× l ) 之值。

18. 整理並歸還分光光度計、比色槽。

五、 實驗結果

吸收度：

Part IV.

最終吸收度 A_final =                    

OPD 全部反應變為 DAP，則樣品溶液中  [DAP]_final  =                       mM

代入 A_final = ε × l × [DAP] _final，可得  ( ε× l ) =                    

六、實驗數據處理：（建議使用試算表軟體簡化工作）

利用計算出之 ( ε× l ) 值，將實驗記錄中的吸收度換算為 DAP 產物濃度（或 OPD 反應物濃度，[OPD]_t = [OPD]₀ – 2 × [DAP]_t ）

[DAP]（或 [OPD]，擇一計算）：

繪製 DAP 產物（或 OPD 反應物）「濃度對反應時間」關係圖

七、問題與討論

1. 在何種情況下，描述酵素催化反應的 Michaelis-Menten 公式能被簡化為反應速率速率 =   (a) k₂[E]₀[S]/K_M   或   (b) k₂[E] ₀ ？

2. 你的實驗結果可套用上題中哪一個簡化公式？你是如何判斷的？

3. 在使用分光光度計進行量測時，(a). 樣品室蓋子為何要保持關閉？ (b). 為何在實驗前，進行吸收度讀數歸零校正時用的是 MES buffer？